摘 要 本试验采用正交试验设计对甘薯愈伤组织诱导研究的几个因素进行了研究，结果表明：影响出愈率的因素从大到小依次为：生长素类（2，4－D +NAA）与BA互作、BA、生长素类、2,4-D/NAA和外植体；各因素的最适水平分别为：生长素类浓度4μmol/L、BA浓度4μmol/L、外植体茎段和叶柄、2,4-D/NAA1:2；对愈伤组织生长速度的影响从大到小依次为：生长素类（2,4-D+NAA）与BA互作、2,4-D/NAA、外植体、生长素类和BA；各因素的最适水平分别为：生长素类浓度4μmol/L、BA浓度4μmol/L、外植体茎段和叶柄、2,4-D/NAA0:3。本文还对甘薯愈伤组织诱导研究中各种因素的关系及应用进行了初步探讨。
一、前言
甘薯（Ipomoea batatas L.）是我省六大作物之一，广泛种植于我省的低山丘陵旱地，其栽培面积达两千多万亩，是我省重要的食用和饲用淀粉来源，养殖业和粮食加工业的重要原料。发展甘薯生产对改善我省农业产业结构，促进养殖业和农产品加工工业的发展，以及我国西部大开发战略的顺利实施都有重要的意义。
但是由于种种原因，近年来所培育的甘薯新品种基本上没有超出南薯88的产量水平，极大地限制了我省甘薯生产的发展；同时，病毒病在我国甘薯产区广泛存在，病毒感染可使甘薯产量下降30-50%，加剧了甘薯品种的退化与减产。因而加强甘薯科研水平，促进我省甘薯生产全面发展的任务非常迫切。
限制甘薯育种成就的主要技术原因有：1、杂交育种对小麦等自花授粉作物而言是非常行之有效的育种方法。但由于自然生态环境条件的限制，甘薯在西南地区基本上不能正常开花，需要采用短日照处理、嫁接等方法来诱导开花。这就给杂交的组配及后代的自交分离重组造成很大的困难。另一方面，甘薯种内绝大部分品种自交不亲和，品种间也广泛存在不亲和性。因此，通过有性杂交的方式进行育种材料间基因交流也受到严重的限制。2、无性变异系选择的效率取决于天然无性变异的频率。栽培条件下天然突变的频率相当低，一般为千万分之一，其中有利变异的频率更低，约为十亿分之一。3、在诱变育种工作中，个体水平和器官水平的诱变后代存在严重的嵌合体现象，发现和分离突变体非常困难，并且诱导突变率也很低。因而天然无性变异选择和诱变育种的效率很难提高。采用现代生物技术方法创造变异类型将极大地提高甘薯育种效率，提高我国、我省甘薯生产水平。
由于病毒感染和传播的特殊性，对于甘薯病毒病的防治目前还没有非常行之有效的化学方法；另外，降低化学农药使用量也是农业可持续发展的必由之路。而通过茎尖分生组织培养，工厂化生产脱毒种苗（薯）是防止病毒危害的有效途径。随着近现代遗传学的发展，形成了一系列新的遗传操作技术，如细胞工程、染色体工程及基因工程等。纵观这些技术均建立在组织培养技术的基础上，而利用各种外植体诱导产生愈伤组织又是组织培养及其它生物技术操作的基础和关键环节之一。
甘薯的组织培养工作开展相对较晚。前人研究表明，甘薯组织培养的出愈率与基因型、培养基中激素的种类、浓度及比例均有密切关系。Gunckel等认为愈伤组织的形成取决于外植体固 的极性、接种方向、品种及培养基。薛启汉认为培养基成分（包括基本培养基的种类、用量）、生长素和细胞分裂素的浓度及配比对愈伤组织的诱导均有一定的影响。分析发现，不同的研究者其得出的结论也有一定的分歧，如：Chée等研究指出2,4-D和BA的共同作用对愈伤组织诱导和培养最为适宜；而赖锦盛等研究指出：2,4-D附加其它生长调节物质，对愈伤组织的诱导是不利的。所以，甘薯愈伤组织诱导系统，特别是激素的作用，是一个很值得进一步探讨的问题。另一方面，前人的研究往往限于个别因素或某几个因素的个别处理组合的研究，没有对愈伤组织诱导系统的各方面因素进行综合全面的研究。
本试验旨在采用正交试验设计，对影响愈伤组织诱导的主要因素进行较为系统的研究，以期针对不同的基本型建立适宜的甘薯愈伤组织诱导系统，为甘薯生物技术育种及脱毒种苗的生产奠定基础。
二、材料与方法
本试验采用本校所收集、保存的部分甘薯品种资源（编号为A051和A033）。对外值、2,4-D+NAA、2,4-D:NAA、BA等四个因素采用正交试验设计，每个因素设计4个水平。选用正交表L32（49）（表1），各因素的水平设置如表2所示。
试验培养基均采用MS培养基为基础，再按上述正交设计处理加入相应成份。其它主要培养条件为培养温度：26±2℃、光照条件为：黑暗培养。每个试验号（处理组合）接种30支试管。
培养过程中考察下列愈伤组织性状：出愈率：分胚性愈伤组织、非胚性愈伤组织及两者之和。计算方法为：产生愈伤组织数÷接种外植体数×100%；生长量；考察愈伤组织块的直径（mm）；质地：分疏松、较硬和坚硬，分析时可以适当数量化；色泽：分白色、淡黄色、淡绿色、绿色、褐色等。
采用极差分析法对出愈率和愈伤组织大小进行分析。
表1 试验方案L32（49）正交表
|
列号
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
|
因素
试验号
|
A：24-D+NAA
|
B：BA
|
A×B
|
A×B
|
A×B
|
C∶外植体
|
D∶24D/NAA
|
||
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
|
2
|
1
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
|
3
|
1
|
3
|
3
|
3
|
3
|
3
|
3
|
3
|
3
|
|
4
|
1
|
4
|
4
|
4
|
4
|
4
|
4
|
4
|
4
|
|
5
|
2
|
1
|
1
|
2
|
2
|
3
|
3
|
4
|
4
|
|
6
|
2
|
2
|
2
|
1
|
1
|
4
|
4
|
3
|
3
|
|
7
|
2
|
3
|
3
|
4
|
4
|
1
|
1
|
2
|
2
|
|
8
|
2
|
4
|
4
|
3
|
3
|
2
|
2
|
1
|
1
|
|
9
|
3
|
1
|
2
|
3
|
4
|
1
|
2
|
3
|
4
|
|
10
|
3
|
2
|
1
|
4
|
3
|
2
|
1
|
4
|
3
|
|
11
|
3
|
3
|
4
|
1
|
2
|
3
|
4
|
1
|
2
|
|
12
|
3
|
4
|
3
|
2
|
1
|
4
|
3
|
2
|
1
|
|
13
|
4
|
1
|
2
|
4
|
3
|
3
|
4
|
2
|
1
|
|
14
|
4
|
2
|
1
|
3
|
4
|
4
|
3
|
1
|
2
|
|
15
|
4
|
3
|
4
|
2
|
1
|
1
|
2
|
4
|
3
|
|
16
|
4
|
4
|
3
|
1
|
2
|
2
|
1
|
3
|
4
|
|
17
|
1
|
1
|
4
|
1
|
4
|
2
|
3
|
2
|
3
|
|
18
|
1
|
2
|
3
|
2
|
3
|
1
|
4
|
1
|
4
|
|
19
|
1
|
3
|
2
|
3
|
2
|
4
|
1
|
4
|
1
|
|
20
|
1
|
4
|
1
|
4
|
1
|
3
|
2
|
3
|
2
|
|
21
|
2
|
1
|
4
|
2
|
3
|
4
|
1
|
3
|
2
|
|
22
|
2
|
2
|
3
|
1
|
4
|
3
|
2
|
4
|
1
|
|
23
|
2
|
3
|
2
|
4
|
1
|
2
|
3
|
1
|
4
|
|
24
|
2
|
4
|
1
|
3
|
2
|
1
|
4
|
2
|
3
|
|
25
|
3
|
1
|
3
|
3
|
1
|
2
|
4
|
4
|
2
|
|
26
|
3
|
2
|
4
|
4
|
2
|
1
|
3
|
3
|
1
|
|
27
|
3
|
3
|
1
|
1
|
3
|
4
|
2
|
2
|
4
|
|
28
|
3
|
4
|
2
|
2
|
4
|
3
|
1
|
1
|
3
|
|
29
|
4
|
1
|
3
|
4
|
2
|
4
|
2
|
1
|
3
|
|
30
|
4
|
2
|
4
|
3
|
1
|
3
|
1
|
2
|
4
|
|
31
|
4
|
3
|
1
|
2
|
R
|
2
|
4
|
3
|
1
|
|
32
|
4
|
4
|
2
|
1
|
E
|
1
|
3
|
4
|
2
|
表2 因素水平表
|
因素
|
A∶24-D+NAA
|
B∶BA
|
C∶外植体
|
D∶24-D/NAA
|
|
1
|
0
|
0
|
叶柄
|
0/3
|
|
2
|
4
|
4
|
叶片
|
1/2
|
|
3
|
8
|
8
|
茎段
|
2/1
|
|
4
|
12
|
12
|
茎尖
|
3/0
|
三、试验结果
1、各种因素对出愈率的影响分析
采用极差分析对试验资料进行分析，其结果列于表3中。从表3可知：在本试验研究的几个因素中，对出愈率的影响从大到小依次为：生长素类（2,4-D+NAA）与BA互作、BA、生长素类、2,4-D/NAA和外植体。
由图1可知，各因素的最适水平分别为：生长素类浓度4μmol/L、BA浓度4μmol/L、外植体茎段和叶柄、2,4-D/NAA1:2。
表3 出愈率正交极差分析表
|
列号
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
出愈率
|
|
因素
试验号
|
A:24-D+NAA
|
B：BA
|
A×B
|
A×B
|
A×B
|
C:外植体
|
D：24D/NAA
|
|||
|
K1
|
468.80
|
469.10
|
643.40
|
427.60
|
490.80
|
610.50
|
402.80
|
507.90
|
575.70
|
2257.50
|
|
K2
|
662.60
|
713.60
|
488.00
|
510.60
|
552.10
|
543.30
|
570.90
|
570.00
|
628.90
|
|
|
K3
|
573.20
|
446.80
|
688.30
|
634.00
|
644.00
|
621.50
|
658.40
|
646.20
|
438.20
|
|
|
K4
|
552.90
|
628.00
|
437.80
|
685.30
|
570.60
|
482.20
|
625.40
|
533.40
|
614.70
|
|
|
A1
|
58.60
|
58.64
|
80.43
|
53.35
|
61.35
|
76.31
|
50.35
|
63.49
|
71.96
|
|
|
A2
|
82.83
|
89.20
|
61.00
|
63.83
|
69.01
|
67.91
|
71.36
|
71.25
|
78.61
|
|
|
A3
|
71.65
|
55.85
|
86.04
|
79.25
|
80.50
|
77.69
|
82.30
|
80.78
|
54.78
|
|
|
A4
|
69.11
|
78.50
|
54.73
|
85.66
|
71.33
|
60.28
|
78.18
|
66.68
|
76.84
|
|
|
R
|
24.23
|
33.35
|
31.31
|
32.31
|
19.15
|
17.41
|
31.95
|
17.29
|
23.84
|
2、各种因素对愈伤组织生长速度的影响
从表4可知：在本试验研究的几个因素中，对愈伤组织生长速度的影响从大到小依次为：生长素类（2,4-D+NAA）与BA互作、2,4-D/NAA、外植体、生长素类和BA。
由图2可知，各因素的最适水平分别为：生长素类浓度4μmol/L、BA浓度4μmol/L、外植体茎段和叶柄、2,4-D/NAA0:3。
表4 愈伤组织直径正交极差分析表
|
列 号
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
大小
|
|
因 素
试验号
|
A:24-D+NAA
|
B：BA
|
A×B
|
A×B
|
A×B
|
C:外植体
|
D：24D/NAA
|
|||
|
K1
|
48.50
|
43.00
|
49.00
|
41.00
|
42.50
|
55.50
|
38.00
|
52.00
|
62.00
|
179.00
|
|
K2
|
57.50
|
58.00
|
25.00
|
43.00
|
44.50
|
40.00
|
45.50
|
28.50
|
46.50
|
|
|
K3
|
38.00
|
41.00
|
59.00
|
36.50
|
56.00
|
55.50
|
49.00
|
53.50
|
36.50
|
|
|
K4
|
35.00
|
37.00
|
46.00
|
58.50
|
36.00
|
28.00
|
46.50
|
45.00
|
34.00
|
|
|
A1
|
6.06
|
5.38
|
6.13
|
5.13
|
5.31
|
6.94
|
4.75
|
6.50
|
7.75
|
|
|
A2
|
7.19
|
7.25
|
3.13
|
5.38
|
5.56
|
5.00
|
5.69
|
3.56
|
5.81
|
|
|
A3
|
4.75
|
5.13
|
7.38
|
4.56
|
7.00
|
6.94
|
6.13
|
6.69
|
4.56
|
|
|
A4
|
4.38
|
4.63
|
5.75
|
7.31
|
4.50
|
3.50
|
5.81
|
5.63
|
4.25
|
|
|
R
|
2.81
|
2.63
|
4.25
|
2.75
|
2.50
|
3.44
|
1.38
|
3.13
|
3.50
|
几种因素对愈伤组织增殖的影响
四、讨论
通过对本试验结果分析可以认为：
（1）生长素类与BA的互作无论对于出愈率还是对愈伤组织的增殖速度来说都是最为重要的因素，因此在进行愈伤组织诱导工作时仅仅把各个因素单独考虑是不够的。至于两者处于何种比例关系最为适当，有待于进一步研究。
（2）各种因素对出愈率和愈伤组织增殖速度的影响程度并不一致，应该根据试验目的选择适当的因素组合以取得最佳的结果。
（3）本试验中，外植体种类对出愈率的影响最小，但对愈伤组织增殖速度的影响比较大。在注重获得愈伤组织量的研究中就予以充分考虑。
（4）生长素类的总量对出愈率的影响作用较小，对愈伤组织的增殖速度的影响较大；并且以NAA为主的生长素类有利于愈伤组织增殖，而两者间呈1∶2的比例有利于愈伤组织产生。
参考文献
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