DNA分子标记技术在甘薯种质资源和遗传育种中的应用现状

    摘要：本文综述了近年来DNA分子标记技术在甘薯种质鉴定，遗传多样性分析，连锁图谱的构建，基因定位，体细胞胚胎发生遗传变异鉴定等方面的应用概况，并对其发展前景进行了展望。

关键词：分子标记；甘薯种质资源；遗传育种

 

THE STAUS OF DNA MOLECULAR MARKERS APPLICATION IN THE STUDY OF SWEETPOTATO GERMPLASM AND BREEDING

Ankang, FangBai-ping,ZhangXiong-jian,ChenJing-yi, FuShi-li

(Crop Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Science, Guangzhou, China)

Abstract: The recent application of DNA molecular markers to the study of sweetpotato germplasm and breeding, which including identification of germplasm, genetic diversity, genetic map construction, gene location ,analysis of genetic variation in somatic embryogenesis.The prospect of DNA mareker further using in sweetpotato were summarized and discussed in this paper.

Key words : Molecular markers; sweetpotato germplasm resourse; genitics&breeding

 

    甘薯是世界上七大作物之一，其种质资源和遗传育种研究在世界作物生产中具有重要地位。DNA分子标记(DNA Molecular markers)是物种遗传变异在DNA水平上的直接反映，与传统的形态标记相比，它具有既不受生物的组织、器官、细胞类型及发育时期的影响，且数量丰富，稳定性好，操作简便等优点而广泛地在资源与育种研究中得到利用。近年来，DNA分子标记技术在甘薯的分类学研究、品种鉴定、系谱分析、遗传作图、基因标签等方面均得到应用。下面就有关内容的研究进展进行综述。

种质资源是作物生产和育种的基础。种质的鉴定是保护优异基因和维持生物多样性的重要手段。由于甘薯品种数量众多，同种异名、同名异种的情况比较普遍，往往对品种收集造成一定的困难。这个问题常因同一品种资源在不同国家存在不同的命名而尤为突出。甘薯品种资源归类，传统上主要依靠形态学进行。但在部分作物无性系中，采用形态学、细胞学、同功酶或生理生化方法常存在难已对其准确鉴定的问题。

DNA是形态学、同功酶、核型特征的遗传基础，其位点和数量十分丰富，是准确进行种质资源鉴定的依据。RAPD、AFLP 和SSR等DNA分子标记已在甘薯品种的DNA指纹得到了应用。例如McGregor等（2001）应用RAPD和SSR标记技术对南非基因库中选出的21份品种和从大田收集的6个农家种进行了比较分析，各品种之间显示出明显的多态性。并进一步采用上述获得的DNA标记对4个不同名称的品种进行了鉴定，结果未发现多态性，这与形态学上分类一致，这些品种其实就是同一份品种资源。该研究结果也表明了DNA分子标记能够进行甘薯品种资源的鉴定，且结果稳定可靠^[1]。

由于DNA分子标记技术直接显示物种DNA水平上的差异，比形态学水平、细胞学水平和生化水平更能准确地揭示植物的遗传多样性，所以在甘薯资源遗传多样性的研究中得到了较为广泛的应用。

S.T.Gichuki等（2000）对来自南美、中美、美国、东非、东亚、南亚、东南亚和大洋州等8个地理区域，23个国家的74个甘薯品种进行了RAPD分析，60个随机引物中52个产生了多态性。其中11个引物产生的71个多态性明显区分不同地域的品种，并且发现同一地域品种间存在着一定的变异^[2]。Zhangdapeng等（1998）对来源于哥伦比亚、厄瓦多尔、秘鲁和巴布新几内亚的36个品种进行了RAPD分析，在选择的80个随机引物中，其中15个共产生89个多态性可以清楚地区分36个品种。通过对总标记变异和平均遗传距离，结果表明了巴布新几内亚、南美群内遗传多样性，与巴布新几内亚品种相比，南美的品种明显地显示出遗传多样性。结果也表明了RAPD技术比以前发现的同工酶和蛋白多样性效率更高。结果也证明了巴布新几内亚品种在隔离环境下经过多年的独立进化和选择，遗传上明显地不同于其南美起源种^[3]。

 

Gichuki等（2000）采用AFLP对165个甘薯品种（158个来自东非，3个来自南中美、4个来自非洲其他地区）进行了分析，采用2个 AFLP 引物组合， 每组单引物组合可获得100 – 200个的片段（50-500 bp）。使用其中的 71 个位点，将东非品种进行了聚类分析。结果表明，遗传多样性与品种地域分布存在着一定的关系^[2]。Dapeng Zhang等（2000）应用AFLP标记对来自墨西哥、秘鲁、厄瓦多尔和太平洋地区的9个品种进行了遗传多样性和亲缘关系的研究。分子变异分析（AMOVA）分析，结合多维扫描（DMS）结果表明，大洋州的甘薯与墨西哥甘薯有亲缘关系，而与来自秘鲁-厄瓦多尔没有联系；与来源于墨西哥的甘薯资源相比，源于太平洋地区的甘薯有很高的遗传多样性；而秘鲁的甘薯品种的遗传多样性水平很低，厄瓦多尔次之，这个结果对史前推断甘薯从秘鲁-厄瓦多尔传入太平洋地区的假说提出了挑战^[4]。

Reddy等（2003）利用SSR标记对不同抗虫性（线虫，叶甲和部分金龟子幼虫）水平的甘薯资源进行了分子学遗传水平分析。不同抗性水平的甘薯资源存在等位基因的多样性，与抗性性状紧密连锁的分子标记可进一步用于对群体多抗虫性的检测^[5]。

Wang J等（1998）对42份中国甘薯品种资源利用随机序列引物进行DNA扩增指纹分析，每个品种资源可以获得12-26条带，平均有19条带具有多态性。供试的中国甘薯品种具有很高的遗传多样性。实验结果表明，DNA扩增指纹为揭示甘薯在中国的历史提供可信赖的证据,揭示了来自广东和福建的农家种在遗传上是显然不同的，表明甘薯有多种途径传入中国而不是广泛众所周知的单一传入途径^[6]。Prakash等（1996）应用DAF技术对30个美国品种遗传系谱关系进行了研究，与现有的血统关系一致，结果证明DAF技术可以用于甘薯资源遗传多样性的研究中^[7]。HeG等（1995）利用DAF对73份包括部分美国品种和部分从世界其他地方所收集的甘薯品种以及进行了遗传关系的分析。结果表明，部分品种因地理来源而放在一族，大多美国品种因表型而放在一族，而来自巴布新几内亚的品种显示出高的遗传多样性。野生种I.triloba和四倍体甘薯形成了明显与其他甘薯品种不同的一群^[8]。

Huang,J等（2000）利用ISSR标记和4个叶绿体DNA的非编码限制位点的变异对40份属于甘薯属10个的野生资源进行了遗传多样性及亲源关系进行了验证。用15个引物获得了2071个片段，平均每个引物可以扩增到52条带，大多数引物含有二核苷酸重复序列。ISSR片段在研究的40个品种中表现出高的多态性（62.2%）。叶绿体DNA限制性分析表明有47个限制性位点及片段变异。ISSR和叶绿体DNA数据的系统分析在中间水平揭示简单的关系，但是高效的ISSR多态性可以导致超亲品系的更好的分离。然而，ISSR和叶绿体DNA数据在解决种间和种内关系时是比较适宜的。在检验的种系中，通过ISSR指标，I..trifida显示出与甘薯种更紧密的亲源性，六倍体巴西牵牛是唯一的与甘薯亲源关系最远的，而I. ramosissima和I. umbraticola与属内其他种关系最远。I. triloba被认为是迄今为止甘薯的一个亲源种^[9]。

 

贺学勤等（2005）用 RAPD、ISSR 及 AFLP 分子标记，对来自中国安徽、福建、河南和广东 4 省的 48 个甘薯地方品种进行遗传多样性分析。3种分子标记结果均揭示中国甘薯地区间差异性，广东地区的地方品种遗传变异高于其余 3 省，并且达极显著差异水平，从分子水平揭示广东应是中国甘薯的最早引入地，并向周边省及内陆地区扩散。地方品种的遗传变异十分丰富，支持中国是甘薯的次生多样性中心的观点。品种遗传变异的研究发现，由 3 种标记产生的聚类图存在一些差异，但将 3 种标记产生的多态性带结合产生的聚类图可以很好地揭示 48 个地方品种的亲缘关系，所有品种聚为两大类，一类以 8 个广东地方品种为主，另一类由剩余的 8 个广东地方品种和其余 3省的 32 个地方品种组成^[10]。

Berenyi Maria等（2002）利用 Rnase H 基因特异性引物和限制性特殊结合位点引物合成和克隆了甘薯TY1-copia反转座子的基因RnaseH-LTR区域。240个片段中，共鉴定出有90个克隆在TY1-copiaRnaseH-LTR存在同源性的变异。其中有3个克隆（Str6,Str85,Str187）具有Rnase H-LTR基因的特征，终止子（ stop codon）多嘌呤足迹以及公认的具有3’ LTR序列单元。利用建立的S-SAP技术对来自非洲、以及南中美洲的（如巴布新几内亚）的9个甘薯资源进行了分析，结果表明大多数（33-64）TY1-copia转座子的内含子是独一无二的，只有检测到少数条带。通过对177份东非甘薯品种的分析结果进一步支持了上述发现，同时也表明了大多copia反转座子位点只代表部分的品种资源。可以想象甘薯在非洲出现不到500年，引进的品种数量也可能很有限，竟然在转座子插入位点让人惊讶地检测到了的高水平的遗传变异。这些发现也表明了近年来推断的甘薯反转座子的功能。对基于S-SAP插入copia转座子的方法和AFLP及RAPD进行了比较，结果显示了绝大多数S-SAP标记有丰富的多态性（97-99%），而AFLP多态性为70-90%，RAPD多态性为88%。因此，这揭示基于转座子的分子标记体系对基因分析是非常有效^[11]。

应用分子标记和同工酶标记相结合, 目前已有数张甘薯连锁图得到构建。例如Ukosit等（1997）^[12]以“Vardaman”X “Regal”的76个后代为材料，利用低密度的RAPD标记构建了图谱。用460个随机引物中重演性的的84个引物产生的196个标记选择用来遗传分析。用非简单/简单（nonsimplex/simplex）RAPD标记的比例以及相引与相斥中simplex RAPD标记的来研究甘薯不能确定的多倍体、autoploidy以及异源多倍体。这两种检测都表明了autopolyploidy的存在。利用simplexRAPD标记的连锁分析构建了低密度的Vardaman”和“Regal”的RAPD标记连锁图谱。二重和三重标记通过人工绘进了simplex标记图谱。应用nonsimplexRAPD标记对同源连锁群体进行了鉴定，结果在两个双亲图谱中各自发现了3个同源连锁群体。Nonsimplex标记提高了图谱的准确性。 Vardaman的图谱以25-cM的间隔覆盖了预定约10.5%的染色体（5024 cM）， Regal的图谱以25-cM的间隔覆盖了约5.6%的染色体（6560 cM）。

Kriegnerl等（1999）利用Two-way seudo-testcross方法改进的AFLP对Tanzania和Bikilamaliya进行了遗传连锁的构建。 在LOD为5的水平，656个母本标记和469个父本标记分别排列在90和80个连锁群体，覆盖了长度为3655.6 cM的Tanzania染色体，覆盖了长度为3011.5cM的Bikilamaliya染色体。平均每个标记的遗传距离为5.9cM.遗传图谱的绘制分2步，先用简单性的标记为后续增加的multiple-dose标记提供构建图谱的框架。母本图含有91个可以鉴定13个同源母本的分离群体的二重标记，父本含有69个可以鉴定10个同源父本的分离群体的二重标记。215个double-simplex bridge 标记与父母本都同源的15个连锁群体。应用相连锁的引与相斥的比例来评价多倍体的类型（同源或异源多倍体）。缺少相斥时期的连锁表明了同源染色替的遗传的多倍性。比较低可信度水平上的相斥连锁，揭示了甘薯上存在有着优先的染色体对^[13]。

利用DNA标记技术通过找出与靶基因连锁的DNA标记，可对目标基因进行定位。一般来说,一次反应中可检测基因组的多个位点，既可定位在某一特定DNA区域特定基因(目标基因),也可为分子图谱上某一区域增加新的DNA标记.

   

 

    甘薯资源中的干物质含量有着很大的差异，变化幅度为18-44%。并以淀粉为主要形式储藏在块根中，淀粉的合成能力在块根的形成和光合中起着中心作用。Xiu-Qing Li等（2001）^]对淀粉合成过程中涉及的基因进行鉴定。分别从柴根和高含淀粉的甘薯中提取mRNA，利用用入-Uni-ZAP XR介体构建了2个cDNA文库。部分文库用来去除转化pBluescript SK-噬菌体克隆的序列分析。通过BLAST，查询到第一组中已鉴定为与碳水化合物的代谢和块根发育中有关的侯选基因的EST，这些EST标签也将应用到遗传图谱上定位。表达的差异性与QTL的一致性将为揭示这些侯选的EST属于淀粉合成和块根形成过程中的主要基因^[14]。

利用进入裂解的光吸收蔗糖产物进行甘薯块根的形成与淀粉的积累的一致性。Li X.-Q等（2003）^[15]利用EST结合RT-PCR对在甘薯块根形成过程中，蔗糖代谢主要途径以及基因的活性进行了研究。块根中的EST在甘薯块根合成了的表达高于须根，蔗糖合成有关的基因是在块根EST中分布最丰富的碳水化合物代谢基因。RT-PCR结果证实了在块根形成过程中难以觉察到的蔗糖合成变为主要的途径。在未成熟的块根个根尖都检测到了转化素的表达，揭示了所涉及到的细胞的形成。蔗糖表达的方式说明与与葡萄糖合成一样，ADP葡萄糖焦磷酸化酶是在淀粉合成中起必要的酶。结果表明：在块根形成过程中，蔗糖合成是蔗糖代谢中表达活性最高的酶。但是，转化酶在细胞形成期活性强，蔗糖途径对淀粉积累时期蔗糖的裂解起主要作用。

同样用EST和RT-PCR对蔗糖代谢途径中涉及到的酶的活性进行了分析，并对与已知的马铃薯淀粉积累过程中，蔗糖代谢作为必要的机制进行了比较。结果发现，尽管这两种作物的储藏器官在植物学上是截然不同的，但是都是选择裂解蔗糖在淀粉积累的途径竟然是明显的相似。

薛启汉等（2000）以“郑红5”等6个甘薯品种为材料，通过离体培养诱导体细胞胚胎发生与植株再生。利用RAPD分子标记方法，在DNA水平上分析甘薯品种间遗传差异以及体细胞胚胎无性系的遗传变异。筛选了45个随机引物,其中7个引物PCR扩增后在品种间和体细胞胚胎无性系中表现RAPD多态性,并在相应胚性愈伤组织中检测到少数RAPD变异位点。证明利用RAPD分子标记方法鉴定甘薯体细胞胚胎发生遗传变异的可行性，以及为通过离体培养条件调控(增加或减少)甘薯体细胞胚胎发生中的遗传变异提供了可靠依据^[16]。