甘薯生物技术研究进展

摘要　新兴的生物技术为甘薯这一古老的农作物带来了新的发展契机。细胞大规模培养、体细胞融合、基因转导等技术的研究和应用，可望从根本上改变甘薯传统的生产和育种模式。本文综合近年来国内外甘薯体细胞胚胎发生、原生质体培养和基因工程等方面的研究进展，对影响甘薯体胚发生体系及原生质体再生体系建立的诸多因素进行了详细论述，讨论了甘薯基因工程研究的应用潜力和目前存在的一些问题。
    关键词　甘薯，体胚发生，原生质体培养，基因工程

Advances in Biotechnological Studies of Sweet Potato

CUI Hong　CHEN Mu-Zhuan

(Biology Department, Xiamen University， Xiamen 361005）

　　Abstract　The development of biotechnology has brought new opportunities for development of crop production of sweet potato (Ipomoea batatas Lam.). The application of the techniques of large_scale cell culture, somatic cell fusion and gene transformation will greatly change the traditional mode of production and breeding of sweet potato. The current advances in somatic embryogenesis, protoplast culture and gene engineering of sweet potato are reviewed in detail. The potential applications of biotechnology in sweet potato and some problems are discussed.
　　Key words　Sweet potato, Somatic embryogenesis, Protoplast culture, Gene engineering

　　甘薯是重要的农作物，一直广泛应用于食品工业、轻化工业和饲料工业。进入80年代以来，人们对于甘薯的营养价值又有了新的认识， 尤其是它在医学保健方面的神奇功效，令世人瞩目。目前我国甘薯常年种植面积在660万公顷左右，仅次于水稻,小麦和玉米，占世界总面积的80％以上。但甘薯遗传上的高度杂合性和种间、种内广泛存在的杂交不亲和性，严重制约了甘薯生产发展，培育高产、优质、抗逆性强、无病毒、耐储藏的优良甘薯品种，仍然是十分迫切的事。 近年发展起来的以组织培养和遗传工程为主导的生物技术，对甘薯生产无疑具有潜在的推动意义，可望从根本上改变甘薯的生产现状。本文拟从体细胞胚胎发生、原生质体培养、基因工程等方面介绍有关甘薯生物技术的研究状况。

1　体胚发生
　　自Murashing(1978)提出利用体胚发生的特点制作人工种子的观点以来，体胚发生研究成为甘薯研究的热点，这不仅是因为人工种子所具有的不可置疑的优越性，而且与甘薯为块根繁殖作物，生产用种量大，储存过程中损耗大有关。尽管目前人工种子策略距生产实践仍有一定距离，但甘薯体细胞胚胎发生系统的建立和完善，特别是生物反应器的利用，对于优良品种快繁，脱毒，种质保存等技术至关重要。甘薯体胚发生的研究虽然起步比较晚，但已在许多方面取得很大进展，尤其是对于影响甘薯体细胞胚胎发生的遗传因素和外源激素的研究，积累了大量经验性资料。
　　遗传因素对体胚发生的影响表现在多层次、多方面。不同植物、不同品种、不同的器官和组织，其体细胞胚胎发生能力各不相同。相对而言，甘薯的体胚发生比较困难，而且品种间差异很大：Jarret等（1984）对9个甘薯品种的试验结果中，只有6个品种能产生胚性愈伤组织，不同品种产生胚性愈伤组织的最适2.4_D浓度从0.1～3.0 mg/L，诱导频率从10%～31％不等； 辛淑英（1994）对10个甘薯品种进行试验，8个品种有体细胞胚出现，其中徐薯18和广薯70_9发生频率最高. Sonnion (1993) 检验了10个无性系，均能产生胚性愈伤组织，诱导频率从11%～67%不等，其中体胚发生频率较高的是Q23728 (67%)。
　　有些植物如胡萝卜，几乎所有器官都可以产生胚状体，而甘薯和大多数植物一样，只有在一定发育时期的某些器官可产生胚状体：蔡新生（1982）报道用“台农31号”诱导胚状体，以茎段来源的愈伤胚性最强，花药来源的次之，块根来源的最差。Chee等（1988）指出诱导胚性愈伤组织最好的部位是茎的生长点，当附着于生长点的叶原基数由0增至8时，诱导频率由90％急剧降至30％。采用的生长点过大容易产生非胚性愈伤组织，过小则容易褐变死亡。Jarret等（1984）对所取生长点的腋芽节位进行的试验表明：生长点取自枝尖，胚性愈伤组织的诱导频率为55％～60％，取自2、3节位为35％，4、5节位为0～25％，6节位以下为0％。这些结果表明，进行活跃细胞分裂的部位，更容易实现体细胞胚胎发生。
　　 由此看来，遗传因素在很大程度上影响了体细胞胚胎发生和植株再生。 但是从另一方面讲，这种影响又并非是绝对的，体胚发生能力是受到遗传背景、生理状态、环境条件等因素的综合影响的。由于基因型不同、所处的生理状态不同，实现胚胎发生所需要的条件也不尽相同。那些不能成功实现体胚分化或分化频率很低的品种，并非因为其没有胚胎发生能力，只是因为所试条件不合适，难以导致与胚胎发生相关基因的启动和表达。近年来，随着培养技术的发展，越来越多的品种，甚至一些以前认为是难以分化的品种都逐渐有了突破，这些事实也证明了上述观点。甘薯有近1?100个品种，而报道有体胚发生并再生植株的仅仅数十种，应在原有基础上，加强对生产上广泛推广的优良品种的研究。
　　外源激素对体细胞胚胎发生的影响是无可置疑的，有些植物在不加任何激素的培养基上就能产生胚状体；有的需要生长素与细胞分裂素的配合；最常见的方式是先用2,4-D诱导胚性，然后在无激素培养基上发育成熟。后两种方式在甘薯中都有报道。Chee（1988，1989）和Liu（1984）等在品种‘White Star’的培养中观察到：胚状体在诱导培养基上长至球形胚便停止发育，移至除去2,4_D的分化培养基上，发育又重新启动。这一反应模式与胡萝卜、芹菜、苜蓿的研究结果类似：2,4_D对胚性愈伤组织的诱导和保持是必需的，而对胚状体的进一步发育成熟有明显抑制作用。另外，2,4_D浓度与愈伤组织的诱导密切相关，不同浓度的2,4_D对胚性愈伤组织的诱导效果不一样，不同品种有各自不同的最适浓度，大致范围在0.5～3.0 mg/L，过高过低都不利于体胚发生。
　　细胞分裂素也是体胚发生过程中不可缺少的，尤其是与生长素配合使用，可以解决许多棘手问题：为了选择性地增殖胚性愈伤组织，Chee等（1988,1989）研究了2,4_D和6_BA的浓度组合对两类愈伤组织生长的影响，发现在附加10 umol/L 2,4_D和1 umol/L 6_BA的MS固体培养基上，胚性愈伤组织的生长量大于非胚性愈伤组织；Desamero等（1994）对Picolinic acid和KT的配合使用也进行了研究，低浓度的Picolinic acid（0.2 mg/L）与KT或6_BA（1.0 mg/L）组合，可抑制芽的发生，诱导愈伤组织的增殖；高浓度的 Picolinic acid（2～3 mg/L）与0.25 mg/L或1.0 mg/L KT配合使用，可诱导品种Regal由顶端分生组织直接产生胚状体，而品种Jewel无体胚发生。
　　ABA在甘薯体胚发生中的作用仍存在争议。Cantilifle等（1992）认为ABA能有效地提高鱼雷胚和子叶胚的形成频率；Qi（1996）在对品种PI318846_3的研究中，将叶片外植体在MS附加2.5 mg/L 2,4_D、0.25 mg/L BAP的培养基上黑暗培养两个星期，而后转至附加2.5 mg/L ABA的MS培养基中光培养，两周后胚状体从外植体表面直接发生，并在MS基本培养基上高频率形成正常植株，认为ABA的使用促进了体胚发生的同步化，体胚发育的正常化，并显著提高了体胚的转换频率。但也有实验表明ABA抑制体胚的发育：辛淑英（1994）曾报道如果将心型胚和球形胚转入含ABA（0.2～0.5 mg/L）的培养基中，体胚将脱分化，变成愈伤组织。可见，ABA对甘薯体细胞胚胎发生的作用具有品种特异性。
　　目前，由于体细胞胚胎发生机制的研究还处于摸索阶段，因而诱导植物体胚发生的工作仍是经验式的，存在相当大的盲目性，只能通过调整激素配比和培养条件去寻找适合不同品种胚胎发生所需要的最佳条件，还无法从根本上有目的地、高效能地调节、控制体胚发生过程。因而也就毫不奇怪，报道中大多数甘薯体胚发生系统都存在发生频率低、同步化程度不高、体胚质量差、胚性难以长久保持等一系列问题。这在很大程度上限制了体胚发生和人工种子在甘薯生产上的应用，而这一问题的最终解决，有待于我们对体胚发生机制的充分理解和阐明。

2　原生质体培养
　　植物原生质体及其衍生系统不仅是探索生命活动理论研究的良好体系，而且还可以对其进行细胞操作和遗传操作，从而改良作物的性状，在生产应用上有巨大潜力。通过原生质体融合实现体细胞杂交，是克服各种杂交不亲和的有效途径。 甘薯存在的种间、种内交配不亲和性，是甘薯育种中难以克服的障碍，严重限制了甘薯育种中的资源利用和亲本选配。近年来，为了解决这一难题，通过原生质体培养进行体细胞杂交的研究，已引起了广泛重视。 甘薯原生质体的分离和培养，起始于本世纪70年代末。吴耀武等（1979）曾报道利用武薯1号茎段诱导出愈伤组织，从中分离大量原生质体，得到了不具分化能力的愈伤组织。Bidney等（1980）在甘薯原生质体培养中，观察到少量不定根的分化。至1987年，Murata 和Sihachaker 分别同时报道从甘薯原生质体中再生植株，但再生频率非常低，在所试的2个品种中，只有DuclosⅪ 获得了原生质体的再生植株。后来，又有一些报道，成功地从甘薯及其近缘野生种原生质体再生植株 (Perera, 1991; 刘庆昌, 1994; Murata, 1994; Belarmino,1993 )，但是，再生频率普遍不高，并且仅仅局限于少数几个品种。因此，甘薯原生质体再生被认为是由基因型所决定的，其不定芽及胚状体的分化还无法调控，仍然需要继续研究，特别是对于那些在生产中应用广泛的优良品种的原生质体再生体系的研究和完善，具有极其重要的意义。虽然已有许多报道从甘薯及其近缘野生种原生质体再生植株，但关于甘薯及其近缘野生种体细胞杂交的成功报道并不多见。刘庆昌（1994）报道用PEG融合法融合甘薯品种高系14号（6x）极其近缘野生种(Ipomoea triloba)（2x）的原生质体，融合频率为28％，并在37个愈伤组织克隆中，得到19株再生植株，经细胞学鉴定，证明为体细胞杂种植株。这一成功，展示了原生质体融合技术在甘薯育种中的巨大应用潜力。
　　原生质体又是遗传工程的理想受体：原生质体可以直接摄取外源遗传物质，包括细胞核、细胞器基因组、DNA片段及病毒颗粒；而且在控制条件下，以单个原生质体进行准确的遗传操作，易于进行转化体的筛选和分析，避免嵌合现象；同时原生质体具有全能性，在适合条件下能再生植株，或进行细胞大量繁殖。因此在植物遗传转化研究中，广泛利用原生质体作为受体系统进行遗传操作。Nishiguchi （1992）利用电激法把编码潮霉素抗性的DNA转移到甘薯悬浮培养物衍生的原生质体中，经过筛选培养，得到了潮霉素抗性的愈伤组织，Southern杂交证实了愈伤组织细胞中含有编码潮霉素抗性的DNA，转化频率为1％。但总的看来，利用甘薯原生质体为受体进行转化的例子不多，主要是由于缺乏重复性良好的原生质体再生体系，这也是目前甘薯原生质体培养中急需解决的关键问题。

3　基因工程
　　基因工程是近年来兴起的热门学科，自1983年成功地用Ti质粒将外源DNA导入植物体内以来，各种作物的基因工程研究如火如荼。由于甘薯遗传上的高度杂合性和广泛存在的杂交不亲和性，使得应用基因工程进行甘薯遗传改良具有特别重要的意义。甘薯的基因工程研究始于1987年，国际马铃薯中心(CIP)和美国路易斯安那州立大学合作，成功地将一个编码高必需氨基酸蛋白的基因导入甘薯（Espinoza, 1987），其后，各国的甘薯研究人员又相继开展甘薯遗传转化方面的研究，以寻求甘薯品质和抗性改良的最佳途径。
　　外源基因导入甘薯较为成功的途径为农杆菌介导和基因枪。和其它作物一样，用于甘薯遗传转化的农杆菌有也两类：根癌农杆（Agrobacterium tumefaciens，简称At），和发根农杆菌（A. rhizogene,简称Ar）。Prakash等（1991）将携带报告基因Gus的At与甘薯叶片、叶柄共培养，得到再生植株，并在叶片微管组织中检测到Gus基因的强烈表达。Dodds(1991)通过Ar与甘薯茎段共培养，同样在转化植株中检测了到Gus基因的表达。除了农杆菌系统外，基因枪也是一种比较理想的转化途径，它容易操作，适应不同组织，并可深入内层。Prakash等（1992）用携带Gus基因的质粒pBI121和pBI221包裹直径1.2 um的钨粒，经过加速后轰击甘薯叶片、叶柄外植体，每次轰击传递0.68 ug DNA和1.5 mg微轰击物。两天后，在附加1 mg/L NAA，0.1 mg/L BA的MS培养基上筛选、培养、分化，大多数外植体产生愈伤组织和根，在其细胞中检测到Gus活性表达，并可保持达一年之久。无论采用哪种方法进行转化，植株再生都是关键的一步。迄今为止，只有在农杆菌介导的转化中得到了再生植株。虽然再生频率不高，但表明农杆菌载体系统可以更进一步地用来改良甘薯品质和抗性，如HEAAE高必需氨基酸蛋白基因及红豆胰蛋白酶抑制基因CpTI和苏云金杆菌毒性蛋白基因Bt的导入和表达，可望改变甘薯的育种现状。
　　当然，单靠外源基因导入来改良甘薯毕竟是有限度的，因为大多数的经济性状是受多基因控制的，数量性状的改良还有赖于DNA水平的高分辨基因连锁图谱的绘制。 在甘薯上，到目前为止，RFLP的应用还仅仅局限在用来分析种间的亲缘关系上（Jarret, 1992）。具体到用RFLP绘制甘薯基因图谱，障碍重重：一是染色体组较大，需要较多的位点来标记，耗费大量人力、物力和时间；二是它的六倍体性，同一RFLP位点可能分布在多个同源染色体上，将给RFLP的结果分析带来困难。目前美国Tuskegee大学正在进行这方面的工作。
　　就目前而言，我国甘薯生物技术方面的工作只是刚刚起步，尤其是外源基因导入和RFLP分析。这主要是由于经费和技术的限制，已有的技术力量大部分投入到了禾谷类大作物上，甘薯未引起应有的重视，这与目前国际范围内的甘薯生物技术研究热潮很不相称。国际马铃薯中心（CIP）正与美、德、日等发达国家进行合作，共同研究甘薯生物技术 ，内容涉及种质保存、抗逆性筛选、原生质体融和、抗病毒研究、抗虫基因的分离和分析、蛋白质改良、RFLP分析等。这些项目的实施，将最终导致甘薯传统育种模式的改变，新技术育种的开始，甘薯优良品种的选育和现有品种的改良，都将取得长足进步。

作者单位：厦门大学生物系　厦门　361005
　　　　　现联系地址：河南农业大学烟草系，郑州　450002

参考文献
　　吴耀武等，1979. 植物学报，21（4）：335～338
　　蔡新生等，1982. 中华农业研究，31：191
　　辛淑英等，1994. 中国甘薯，183～186
　　刘庆昌等，1994. 中国农学通报，10：24～28
　　刘庆昌等，1994. 农业生物技术学报，2：85～89
　　Belammino M et al, 1993. Japan J Breed, 43(Suppl. 2): 15
　　Bidny D L, Shepard J F, 1980. Plant Sci Lett, 18: 335～342
　　Chee R P, Cantliffe D J, 1988. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 15: 149～159
　　Chee R P, Cantliffe D J, 1989. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 17: 39～52
　　Chee R P, Cantliffe D J, 1992. Hortscience, 27(12): 1314～1326
　　Desamero N V, Billy B R, 1994. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 37(2): 103～111
　　Dodds J H, 1991. Hill W A et al(eds), Sweet potato Technology for 21st, pp 7～19
　　Espinoza N O et al, 1987. Bioessay, 6: 261～267
　　Jarret R L, Slalazar S, 1984. Hort Science, 19(3): 397～398
　　Jarret R L, Gawel N, 1992. J Amer Soc Hort Sci, 117: 633～637
　　Liu J R, Cantliffe D J, 1984. Plant Cell Report, 3:112～115
　　Murata T, Hoshino K, 1987. Japan J Breed, 37: 291～298
　　Murata T et al, 1994. Breeding Science, 44: 35～40
　　Nishiguchi M, Uehara Y, 1992. In Vitro, 28(3): Pt 2_126A
　　Perera S C et al, 1991. Journal of the American Society for Horticulture Science, 116: 917～922
　　Prakash C S et al, 1991. Sweet potato Technology for 21st, W.A. Hill, et al (eds). pp53～58
　　Prakash C S, Varadarajan U V, 1992. Plant Cell Report, 11: 53～57
　　Qi zheng, Anata P D, 1996. Plant Cell Report, 15: 381～385
　　Sihachake D et al, 1987. Plant Cell Report, 6: 326～328
　　Sonnino A, Mini P, 1993. Acta Hoticulture，336: 239～243